高度还原型聚酮化合物的生物合成

2022-03-21版权声明我要投稿

  摘要:真菌来源的高度还原型聚酮合酶(highly-reducingpolyketidessynthases,HRPKSs)由于具有多个还原结构域,可以催化产生还原型聚酮,主要是线性和环状非芳香族化合物。但目前为止已经挖掘出多种类型的HRPKSs,远远超出以往人们对HRPKSs只能催化非芳香类聚酮的认知。本文综述了组成HRPKSs的结构域及各个结构域的功能,并对高度还原型聚酮化合物(highly-reducingpolyketides,HRPKS)的合成过程进行了大致的介绍;另外还综述了近年来挖掘出的新颖HRPKS,加深人们对HRPKS合成机制的认知,以期为更多未知HRPKS的挖掘提供理论参考。

  关键词:真菌;HRPKSs;结构域;合成;挖掘

  真菌来源的聚酮化合物(polyketides,PKS)是由聚酮合酶(polyketidessynthases,PKSs)催化形成的,其活性由组成PKSs的模块决定,即相互独立、线性排列、共价结合甚至可以重复使用的一个个结构域。不同的模块以及不同的排列顺序使不同来源的PKS形成不同的产物,并衍生出同分异构体。而同分异构体进一步导致了产物物化性质的千差万别,也让PKS拥有了更为多样的生物活性。

  到目前为止,人们已经发现了七种不同骨架的PKS:大环内酯类(红霉素)、多烯类(制霉菌素)、芳烃(四环素)、[4+2]环化类(洛伐他汀)、聚醚类(沙拉里菌素)、聚酮-非核糖体肽杂合类(雷帕霉素)以及聚酮-萜杂合类(烟曲霉素)。这些类型的PKS及衍生物已经在医疗、农牧业等方面得到了广泛的运用。与人类认知不同的是,仅在癌症治疗方面,早在二十世纪四十年代就已经开始了PKS及衍生物的使用,在各类药物中占比高达47%[1]。

  但由于发掘手段的单一,科学家对疾病研究的深入,以及人体对抗生素耐药性的产生,使人们更加迫切地想要寻找新型PKS及其衍生物作为药物研发的来源。因此,通过PKS及其衍生物研发新型药物理所当然成为目前最热门的研究项目之一,而发掘新颖的高度还原型聚酮合酶(highly-reducingpolyketidessynthases,HRPKSs)就是其中非常重要的一环。

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  1.1HRPKS的分类

  根据PKSs的结构和性质,可以将PKSs分为Ⅰ型(type-ⅠPKSs)、Ⅱ型(type-ⅡPKSs,也叫迭代型)和Ⅲ型(type-ⅢPKSs,也叫查尔酮型)[2],根据对组成模块的利用,还可以将Ⅰ型PKSs细分为非重复利用多模块型(modularPKSs,mPKSs)(即多个独立但无法重复使用的模块组成的模块型PKSs)和重复利用多模块型(iterativePKSs,iPKSs)(即只有一套结构域,但可以反复利用的迭代型PKSs)两种类型。现有的研究表明,真菌拥有的主要是Ⅰ型iPKSs(图1),而基于产物碳主链还原程度的不同还可以进一步将其分为非还原型(non-reduced,NR)、部分还原型(partiallyreduced,PR)和高度还原型(highlyreduced,HR)PKSs[3]。HRPKSs催化合成高度还原型聚酮化合物(highly-reducingpolyketides,HRPKS),如洛伐他汀(图1),主要是线性和环状非芳香族化合物,但绝不仅局限于这一类型,目前发现有许多HRPKSs可以催化不同类型的PKS,将在下文中详细介绍。NRPKSs则主要催化芳香类聚酮化合物的合成,如黄曲霉毒素B1。根据现有的报道[4],PRPKSs主要合成6-甲基水杨酸(图1)。Ⅰ型mPKSs则在细菌中被广泛发现,甚至还有测序结果发现,一些丝状真菌中存在Ⅲ型PKSs[5],这与以往人们认为Ⅲ型PKSs仅存在于植物和细菌中的认知大相径庭,也为研究者挖掘新颖真菌来源的PKS增添了更多可能。

  1.2HRPKS的组成结构

  想获得新颖的HRPKS,需要了解其合成原理,而HRPKS又是由HRPKSs催化形成的,因此,必须先清楚HRPKSs的组成结构。

  真菌Ⅰ型iPKSs的结构与催化合成哺乳动物的脂肪酸的合酶过程较为类似(图2),脂肪酸合酶是大型多功能蛋白,合成脂肪酸的肽段中就包括酮基合酶(ketosynthase,KS)、酰基载体蛋白(acylcarrierprotein,ACP)、硫酯酶(thiolesterase,TE)、丙二酰/酰基转移酶(malonyl/acyltransferase,MAT)、酮还原酶(ketoreductase,KR)、烯基还原酶(enoylreductase,ER)和脱水酶(dehydratase,DH)等结构域来催化各个功能的实现。

  同样,Ⅰ型iPKSs的基因簇也是单个开放阅读框,其中的结构域同样也包括:KS催化C-C键的形成,使主链得以延长;酰基转移酶(acyltransferase,AT)运送不同的酰基基团至C-C主链;ACP负责接收和传递AT运送的酰基基团,这三种是PKSs必备的结构域,也是聚酮化合物形成骨架的基础。其他功能的结构域还有:起始单元酰基转移酶(starteracyltransferase,SAT),负责对起始单元进行特异性选择,并通过将起始单元转移到ACP结构域上来启动PKS的合成[6];产物模板(producttemplate,PT)负责选定聚酮化合物主链环化反应的区域,并决定产物的最终结构[7];TE位于C末端,催化环化反应,形成大环内酯,且具有纠错功能,这些是NRPKSs的标志性结构域。另外的一些结构域如KR、DH、ER这三个可选择性功能域是该篇综述所要介绍的HRPKSs的标志性结构域,而PRPKSs存在一个核心域,其他结构与HRPKSs类似,只是所拥有的可选择还原性功能域并不完整,无法进行彻底还原,因此被称作部分还原型PKS,除此之外,HR-PKS还具有C-甲基转移酶(C-methyltrans-ferase,CMeT)[8]。

  不同的是,Ⅰ型iPKSs与脂肪酸合酶相比具有更高的程序性以及更为复杂的编程过程[3],例如Ⅰ型iPKSs可以通过在不同的迭代中更改α-和β-碳加工的程度,从而达到产物还原度由低到高的改变。而对于这一程序的理解才是进行改变底物修饰、预测产物结构、合理设计新骨架等一系列发掘新颖HRPKS操作的重中之重。

  1.3HRPKS的合成过程

  HRPKS的主链合成过程大致描述如下。首先丙二酰硫酯在KS的催化下重复Claisen脱羧反应、构建碳骨架,再由AT结构域选择一个二碳短单元,并将该二碳单元装载至ACP域,最后由接受了上游模块合成的聚酮链的KS域与带着二碳单元的ACP域相互结合,形成一条延长了两个碳单元的长链,而其他的KR、DH、ER等结构域则负责对底物进行进一步的处理修饰:KR可以把合成的β-酮基还原为β-醇;DH让β-酮脱水,成为不饱和的烯酰基,甚至可以成为双键;ER则还原不饱和烯酰基或双键为亚甲基,从而达到产物复杂多样化的目的。HRPKSs拥有的这三个β-酮加工结构域(KR、DH、ER)在每个延伸周期中可以选择性催化多达三个β-酮。而CMeT可以将S-腺苷甲硫氨酸作为辅因子,对扩展的聚酮链上的α-碳进行甲基化[9]。一直以来,人们认为HRPKSs不存在像NRPKSs一样内置的释放域,而是通过使用游离的TE域、SAT域来进行水解或酯交换反应,从而完成与释放酶相同的功能,但Tang等[10]发现了带有融合TE结构域末端的HRPKS,更进一步阐述了HRPKS不同的释放机制。

  一些HRPKSs具有催化稠合非芳族环形成的能力[11],可以通过分子内环加成反应来增加线性碳主链的结构复杂性。甚至有些HRPKSs可以与非核糖体肽合成酶(non-ribosomalpeptidesynthetase,NRPS)结合[12],形成氨基酸与聚酮杂合的PKS-NRPS。不仅如此,Huang等[13]发现,HRPKSs还可以作为独立的生物合成基因簇(biosynthesisgenecluster,BGC)的核心酶与其他BGC协同催化PKS的生成。除此之外,Dai等[14]在Curvulariasp.中表征出一个可以合成吲哚苯胺生物碱的高度还原型聚酮合酶CuaA;还有些HRPKSs的研究已经超出了Ⅰ型iPKSs的范畴,可以与Ⅲ型PKSs一同催化聚酮的生成;Kaneko等[5]通过对蟋蟀内生真菌的基因簇进行预测挖掘,发现了一个HRPKSs、Ⅲ型PKSs和P450基因组成的独特BGC,产生了新型的Z,E,Z-三烯基元的烷基间苯二酚。甚至有研究表明,HRPKSs可以催化水杨醛类芳香聚酮化合物,如Liu等[15]挖掘并验证了水杨醛和环氧环己烯醇的生物合成途径,揭示出HRPKS中的β-OH被选择性地再氧化为β-ketones,分子内羟醛缩合形成芳香族产物酮的合成途径。这些研究发现,HRPKS比想象中更大且更加复杂,也使人们对高度还原的聚酮分析起来更加困难,并且真菌中HRPKS与其他类型化合物杂合的结构在现代一些软件的预测中被发现是相当普遍的。尽管这种复杂的结构一定程度上阻碍了人们对HRPKS进行更为深入细致的研究,但换个角度思考,它也为发现HRPKS的新颖结构提供了不同的视角。

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  2.1软件预测

  随着全基因组测序技术和各种“组学工具”的发展,天然产物的挖掘方式也在悄然发生着改变(图3),从传统的直接发酵,到现在已经创建了基于“组学数据”来进行挖掘、鉴别和表征天然产物生物合成途径的工具及数据库,为研究者提供了尽可能详尽的生物信息学资源[16]。如EasyFig[17]可以对多个基因组位点进行可视化的线性比较;可对基因进行筛选的GeneSpy[18],以及将基因组邻域数据可视化的GeneGraphics[19]等。这些软件中,antiSMASH[20]以其强大的数据整合能力和较短的数据处理时间成为天然产物基因组挖掘过程中使用最为广泛的软件。将待预测真菌的全基因组提交至antiSMASH可获得BGC的准确分类,再从PKS这一类型中筛选出含有KR、DH、ER结构域的基因簇即为HRPKSs。

  生物合成

  众所周知,真菌在实验室条件下是很难表达BGC的。尽管研究表明尚有百万种真菌BGC未被鉴定[21],但基因簇沉默、表达量低下、表达条件苛刻都成为发掘新颖HRPKS的阻碍。因此,要想让HRPKS顺利合成,还需对调控HRPKS合成的元件进行有目的的改造。

  2.2.1

  特定途径的调控元件编码序列较为保守,通过生物信息学的鉴定可以很容易就识别出来,因此对于特定途径调控元件的操纵是发掘HRPKS最为便捷的方法之一。通过过表达特定途径的调控元件可以让原本低表达甚至不表达的HRPKS产量增加,从而简单地鉴定出代谢产物。如Chiang等[22]通过软件在同一真菌中预测出HRPKSs和NRPKSs两种不同的PKSs,也发现了控制这两个PKSs合成的转录调控基因alcA;通过对alcA的过表达,产生了新的聚酮化合物。Xu等[23]通过控制ToyA的过表达,使改造菌与野生型相比,丰卡霉素的产量大幅增加。

  但通常PKS的产量都难以达到理想化水平,这主要是因为前体物质供应不足或表达宿主体内缺乏相关的生物合成酶。前体物质供应不足的问题主要出现在异源表达的宿主体内,如原核生物无法合成真核生物所需的前体,真核异源宿主体内缺乏PKS合成的前体物质等,可以通过在表达环境中添加前体物质,或在异源表达宿主体内引入前体合成途径来解决[24]。

  全局转录因子通常在更高的代谢水平来进行调控,从而传递环境信号。例如,黄曲霉毒素和精囊藻毒素的产量会随着环境中pH值的升高而降低,而通过对全局转录因子PAC-3的过表达,可以模拟碱性环境,从而使二者的产量降低[25]。对于全局转录因子的操纵会影响那些容易受到相应环境刺激的天然产物的产生,同时,也因为全局转录因子总是参与到庞大而复杂的代谢网络中,在这一类型的转录元件上进行操作可能会导致真菌的代谢产生翻天覆地的变化,这种变化极有可能朝着与实验预期完全相反的方向走去,很多实验表明全局转录因子只能影响与真菌的生长有关或已知代谢产物的产生,却无法产生新的天然产物[26],更别提能够特定表达HRPKS的基因,因此通过全局转录因子进行调控具有极大的不确定性。

  通过表观遗传学的遗传操作也能够对沉默的基因簇产生很好的调控效果,例如可以通过敲除或过表达组蛋白修饰基因,甲基转移酶如AflSet1[27],乙酰转移酶如CalD[28],去甲基化酶如H3K4[29]或去乙酰化酶如HdaA[30]等来引起染色质重塑,从而导致位于染色质异质区基因簇的活化。因此,可通过表观遗传学操作来定向活化位于异染色质区域的HRPKSs,更加有针对性。

  不同的调控元件有其独特的调节机制,人们可以通过这些机制来获得新的HRPKS。随着更多的调控元件和调控机制被表征出来,相信会有越来越多的PKS被发掘,而这也大部分依赖于生物预测软件的准确度。计算机技术的飞速进步带动了各行各业的发展,生物学也不例外,所以生命科学的发展少不了与各个学科的联动,在计算机技术的帮助下,人们还会发现更多天然产物的合成策略,来消除真菌PKS的化学多样性。

  表达载体

  同源表达和异源表达两种方式各有利弊,同源表达对宿主本身的要求较高,需要生长周期短(易于培养)、生存环境较为温和(实验室可创造)、萌发孢子(能够制备原生质体)、对抗生素较为敏感(易于进行抗性筛选)等。而异源表达则可以挑选生长、繁殖、营养等特性较为明确的模式菌,方便进行操作和控制,真菌异源表达最常用的宿主是构巢曲霉,其应用相当成熟,当然也有其他的高效表达系统在源源不断地补充进来。如Cheng等[31]先证实了真菌Calcarisporiumarbuscula主要产生高度还原的聚酮类真菌毒素aurovertins,再利用aurovertins的空突变体作为一个有效的宿主,筛选出两个基于RNA-Seq的强启动子aurBp和A07068p,成功地激活了C.arbuscula,获得了高效的表达系统,为基因组挖掘提供了非常有效的工具。Hashimoto等[32]对产生asteltoxin的Emericellavarie-color菌株的HRPKS在由米曲霉构建的异源宿主中进行了异源表达,产生了两个C-4相对构型相反的酮内酯。但是,异源表达的宿主不具备同源宿主所拥有的前体物质,而前体物质的再引入对于实际操作来说仍然具有一定的难度,因此需要衡量利弊,根据实验难易程度挑选最合适的表达载体。

  3

  HRPKSs从最初人们所知道的可以催化稠合非芳环体系的形成,到现在不断增加的结构复杂性(催化芳香类聚酮、吲哚类生物碱;和NRPS形成具有氨基酸的杂合聚酮化合物;和Ⅲ型PKS共同作用等)。这一系列的研究都昭示着HRPKSs的化学多样性远超人们想象,作为编程最为复杂的Ⅰ型iPKS,HRPKSs的合成潜力仍然需要不断被发掘。但同时也因为HRPKS复杂多变的结构,阻碍了人们的探索脚步。人们对于HRPKS的合成机制不能达到完全的了解,就是摆在HRPKS系统异源重构工作面前最为棘手的难题。

  本文通过对最近几年在HRPKSs方面的研究进行初步介绍,期望能打破对于HRPKSs合成线性或环状非芳香类化合物认识的禁锢,拓宽传统印象中HRPKS所拥有的结构。目前,想要消灭HRPKS的化学多样性仍然需要更多的信息来准确地预测HRPKSs及其对应的产物。期待计算机技术早日与生物信息学高效结合,生成一个能够对PKSs迭代催化反应进行可靠计算的模型,精准预测这些巨型合酶的催化产物,有效地扩大PKS的化学空间。

  参考文献

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  [9]MaSM,LiJW,ChoiJW,etal.Completereconstitutionofahighlyreducingiterativepolyketidesynthase.Science,2009,326(5952):589-559

作者:李 静,李 力 单位:福建师范大学生命科学学院

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