IBR病毒抗体竞争ELISA检测方法的建立

2022-03-21版权声明我要投稿

  摘要:试验建立了IBR病毒抗体竞争ELISA检测方法,并进行了验证。经试验研究,封闭液用1.5%Casein酪蛋白、包被液用0.02M的PB溶液、包被浓度为1/1 000,酶标单抗浓度为1/1 000,酶稀释液为小反刍酶稀时,该IBR病毒抗体竞争ELISA检测方法的灵敏度和稳定性最佳,此时的板内变异系数为7.7%,板间变异系数为9.41%,均低于10%,且热稳定性良好。试验建立的竞争ELISA抗体检测方法具有良好的稳定性、特异性和灵敏度,可用于IBR病毒抗体的检测。

  关键词:牛传染性鼻气管炎;gD蛋白重组蛋白;竞争ELISA;

0 引言

  牛传染性鼻气管炎(Infectious Bovine Rhinotracheitis, IBR)是由牛传染性鼻气管炎病毒(Infectious bovine rhinotracheitis virus, IBRV)引起的一种牛的传染病,表现为上呼吸道感染及气管黏膜炎症,呼吸困难,一般伴随着发热、沉郁、食欲不振、流产和产奶量下降等症状[1]。牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)所有蛋白中gB、gC、gD和gE 4个糖蛋白是IBRV的主要抗原,而gD蛋白被认为是刺激机体产生中和抗体的主要糖蛋白,它不但能诱导体液免疫,还可诱导细胞免疫[2],是目前IBRV特异性诊断的主要抗原。

  该病呈世界性流行,我国部分地区也多有发生。IBR被国际兽疫局(OIE)列为B类疾病,在我国《中华人民共和国进境动物检疫疫病名录》中也被列为二类传染病[3]。牛传染性鼻气管炎病毒危害巨大,加强牛传染性鼻气管炎病毒的实验室检测有助于疾病的早期诊断和防治[4]。

1 材料与方法

  1.1 试验材料

  1)试剂与样品。

  牛传染性鼻气管炎gD重组蛋白(公司实验室保存)、IBRV单克隆抗体(公司实验室保存)、牛血清样本(公司采集的临床样本)、比对试剂盒(购自IDEXX公司)。

  2)主要仪器设备:

  酶标仪(购自Thermo)、恒温培养箱(购自林茂科技(北京)有限公司)、冰箱(青岛海尔生物医疗股份有限公司)、离心机(上海菲恰尔分析仪器有限公司)、移液枪(赛默飞)。

  1.2 结果判定

  当S/N≥0.5时,判定为阴性;当S/P<0.5时,判定为阳性。

  1.3 试验条件的确定

  1)对包被液的初步筛选。

  按照实验步骤进行试验,封闭液用1.5%Casein、包被抗原用牛传染性鼻气管炎病毒gD重组蛋白、酶标标记牛传染性鼻气管炎病毒的单克隆抗体,在以上条件的工作浓度均为为1/1 000的情况下,分别选用CB、1/10CB、0.2M PB、0.02M PB、0.01M TB为包被液进行试验,试验结果如表1所示。

  通过试验对5种包被液进行比较,初步确定包被液为0.02M PB、封闭液为1.5% Casein酪蛋白、gD重组蛋白包被浓度1/1 000、酶标单抗浓度为1/1 000。

  2)对封闭液,gD重组蛋白包被浓度及酶标单抗工作浓度进行初步筛选。

  结果显示,当封闭液选用1.5% Casein, gD重组蛋白包被浓度为1/1 000,酶标单抗工作浓度为1/1 000时,抗原抗体使用效价最高且阴阳区分明显。

  3)对酶结合物稀释液筛选。

  在初步确定包被液为0.02M PB、封闭液为1.5% Casein酪蛋白、gD重组蛋白包被浓度为1/1 000、酶标单抗浓度为1/1 000的基础上,分别以gB酶稀、鸭疫酶稀、猪瘟酶稀、猪瘟酶稀、小反刍酶稀和PBST作为酶结合物稀释液进行试验,结果小反刍酶稀阴阳区分最明显,因此本试验选用小反刍酶稀作为酶结合物稀释液。

  4)阴阳判定条件的确定。

  用ROC曲线来确定临界值,敏感性代表阳性检出率,特异性代表因阴性检出率;用竞争ELISA检测方法检测样本178份,由ROC曲线可得,当相关标准>0.516时,Youden指数最大,所以确定S/P=0.5为临界值;即当S/N≥0.5时,判定为阴性;S/P<0.5时,判定为阳性。

2 结果与分析

  2.1 精密性

  2.1.1 板内精密度实验

  在同一板内用同一牛血清进行竞争ELISA方法检测,计算变异系数,计算可得,板内OD值的平均值为1.083,标准差为0.083,变异系数为7.7%,低于10%,符合板内精密度要求。

  2.1.2 板间精密度实验

  从12块不同包被板上分别各取一列组成新板,然后用同一牛血清在相同条件下进行竞争ELISA方法检测,计算变异系数,计算可得,板内OD值的平均值为0.933,标准差为0.088,变异系数为9.41%,低于15%,符合板间精密度要求。

  2.2 热稳定性

  2.2.1 包被板热稳定性考察

  选取8个样本,在4℃、37℃下分别放置7 d、11 d测包被板的OD值考察热稳定性,对比检测结果包被板37℃放置7 d, 11 d包被板的OD值没有明显降幅,热稳定性良好。

  2.2.2 酶结合物热稳定性考察

  将4组酶结合物在4℃和37℃条件下分别放置7 d、11 d, 测其OD值评价热稳定性,数据可得,酶37℃放置7 d降幅20%左右,11 d降幅22%左右,酶结合物热稳定性良好。

3 结论

  1)本试验以gD蛋白重组蛋白为包被抗原建立了牛传染性鼻气管炎病毒抗体竞争ELISA检测方法,当实验条件是封闭液用1.5%Casein酪蛋白、包被液用0.02M的PB溶液、包被浓度为1/1 000,酶标单抗浓度为1/1 000,酶稀释液为小反刍酶稀时,该竞争ELISA检测方法的灵敏度和稳定性最佳。

  2)在IBRV的主要蛋白中gD基因编码的糖蛋白免疫原性良好,能够诱导最好水平的免疫应答抗体[5]。除此之外,它能够同时诱导体液免疫和细胞免疫,因此也可以对IBRV疫苗免疫牛的免疫情况进行评价[6]。Hutchings[7]等分别用gB、gC和gD免疫鼠和牛,结果显示gD糖蛋白引起的细胞免疫效果更高而持久。祖立闯[8]等以截短表达的gD蛋白作为抗原建立IBRV间接ELISA检测方法,与全病毒ELISA相比较具有较高的敏感性和特异性。因此,在IBRV的所有蛋白中gD 蛋白被作为IBRV特异性抗原研究的首选。

  3)本研究建立的gD-竞争ELISA诊断方法,除了能够对感染牛进行诊断,还能用于IBRV疫苗免疫的免疫情况评价,为我国IBR的诊断、疫苗免疫水平监测进出口检疫等提供了一种简单的、快速的、价格低廉的血清学诊断方法,一定程度上促进了养牛业的健康发展。

参考文献

  [1] 陈林军,于志超,赵治国,等.牛传染性鼻气管炎研究现状[J].动物医学进展,2019,40(91):102-106.

  [2] Kobay Ashi M,Inoue K,Warabi E,et al.A simplemethod of isolating mouse aortic endothelial cells[J].J theroscler Thromb,2005(12):138-142.

  [3] 陈圣军,孔繁德,徐淑菲,等.牛传染性鼻气管炎检测方法的研究进展[J].经济动物学报,2013,17(1):37-40+48.

  [4] 刘清荣.牛传染性鼻气管炎病毒检测方法研究进展[J].中国动物保健,2020,22(3):18+23.

  [5] 魏鑫.牛传染性鼻气管炎病毒gD基因的原核表达及免疫学特性研究[D].呼和浩特:内蒙古农业大学,2019.

  [6] Marshall R L,Israel B A,Letchworth G J.Monoclonal antibody analysis of bovineherpesvirus-1 glycoprotein antigenic areas relevant to natural infection[J].Virology,1988,165(2):338-347.

  [7] Hutchings D L,van Drunen Little-vanden Hurk S,Babiuk L A.Lymphoeyte proliferative responses to separate bovine herpesvirus 1 proteins in imune cattle[J].J Virol,1990(64):5114-5122.

  [8] 祖立闯,朱远茂,王延辉,等.牛传染性鼻气管炎病毒重组gD蛋白间接ELISA方法的建立及应用[J].中国预防兽医学报,2008(7):537-543.

作者:刘近 任雪建 杨转 姬杰菲 单位:禾旭郑州生物技术有限公司

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